用 irCLIP-RNP、irCLIPv2 和 Re-CLIP 检测并表征细胞内蛋白–RNA 复合体

转录组范围的方法用于在活细胞中绘制 RNA–蛋白质相互作用，为解析核糖核蛋白（RNP）组装体的复杂性及其在转录后调控中的作用提供了强大工具。在此，我们介绍三种相互关联的、基于交联和免疫沉淀（CLIP）的流程：irCLIP-RNP、irCLIPv2 和 Re-CLIP，它们能够鉴定和表征目标 RNA 结合蛋白（RBP）附近的 RNA 依赖性关联蛋白（RDAP）。在构建红外（IR）生物素化 DNA 接头后，这些方法结合了紫外交联、部分 RNase 消化、蛋白特异性免疫沉淀和 3′ DNA 接头连接，随后采用不同的下游工作流程：质谱用于 RDAP 鉴定（irCLIP-RNP）、RNA 测序用于绘制结合区域（irCLIPv2），或第二次免疫沉淀结合测序用于相互作用验证（Re-CLIP）。定制的生物信息学流程分析富集的 RDAP 或显著结合位点，为近端 RNA–蛋白质相互作用提供机制性见解。与传统 CLIP 方法相比，这些流程能够解析相邻相互作用，将 RBP 与其 RDAP 更精确地关联起来。该工作流程适用于多种情境，如细胞状态转换和刺激响应。它需要 RNA 生物化学、下一代测序和计算分析方面的专业知识。整个流程从细胞收集到数据分析可在 7–10 天内完成，为研究转录后调控网络提供了稳健的工具包。

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