NPlasmid-seq：Cas9 编码末端特征实现载体与 IVT 模板质粒的分子级纳米孔质量控制

基于共识的质粒质量控制可能忽视制备样品内部的结构异质性。我们开发了 NPlasmid-seq，一种 Cas9 引导的纳米孔测序工作流程，它通过在预定义骨架位置产生的配对末端特征来编码样本身份，而无需样本特异性寡核苷酸条形码。我们对 24 条 sgRNA 进行了切割验证。在五个代表性指定读段分箱中，每个分箱都与其对应参考序列表现出最强的序列一致性。污染物检测通过一个单一类别特异性分类器进行评估，该分类器同时应用于计算读段混合物和物理 DNA 混合物，从而将两种设计置于同一尺度上。在 5,000 条读段的计算读段混合物中，在 0.2%、0.5%、1% 和 5% 丰度下，全部 20 个独立子样本中均检测到污染物；在 0.1% 丰度下，20 个子样本中有 13 个检测到污染物；全部 100 个子样本的精确度为 1.000，在来自所声明目标质粒的 493,200 条读段中无假阳性判定。在经切割、混合文库制备和测序的物理 DNA 混合物中，以 0.5 mol% 投入量制备的六个样本和以 1 mol% 投入量制备的六个样本中均检测到污染物。观测到的读段比例未能区分 0.5 和 1 mol% 投入水平。相反，它们在制备池之间系统性相差 4.0 倍，这一效应大于两个投入水平之间的差异。因此，我们将该工作流程解释为亚百分比污染的检测器，而非定量器。读段水平分析在一个已通过基于共识质量控制的制备样本中，于 61.7% 的读段中鉴定出一个反复出现的 93-bp 缺失。对 24 个菌落进行 Sanger 基因分型，在 10 个菌落中鉴定出缺失型图谱，在三个菌落中鉴定出完整型图谱。其余 11 个菌落在诊断位点显示双峰，与单个克隆内两种序列形式共存一致。在体外转录模板质粒中，较长的 poly(A) 片段与较高的多聚体读段比例相关。在十对匹配的 A90 培养物中，与 37 度相比，30 度培养降低了这些比例（配对 t 检验，P = 0.0098）。这些测量描述的是回收的读段群体，而非绝对分子丰度。因此，NPlasmid-seq 通过揭示制备样品内的序列和结构异质性，以及通过鉴定与较低多聚体读段比例相关的培养条件，补充了共识验证。

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