保比超分辨FLIM用于定量活细胞寿命成像

超分辨（SR）荧光寿命成像有望提供分子环境与功能的纳米尺度图谱，但光子受限的采集与计算重建可能扭曲寿命估计，尤其是在超分辨条件下由比值推导的频域测量中。在此，我们提出结构光照频域FLIM（SIM-fdFLIM），一种将商用双抽头fdFLIM检测与保比值重建相结合的超分辨寿命成像平台。SIM-fdFLIM采用直流（DC）稳定化寿命估计以提升低信噪比条件下重建的稳健性，随后通过比值域积分变分估计（RIVE）校正通道配准误差并抑制超分辨重建后的噪声放大。该方法在寿命图上实现约100 nm的空间分辨率，并可在56 x 56 {micro}m2视场上以2.8 Hz进行活细胞成像。在代表性荧光团标准品中，相对于非RIVE的SIM-fdFLIM，RIVE将寿命标准差降低约三倍，同时保持平均寿命与校准宽场fdFLIM一致。在活细胞中，SIM-fdFLIM可分辨线粒体嵴尺度的寿命异质性、线粒体间的功能动态、纳米尺度脂质环境变化以及对扰动敏感的细胞器接触特征。这些结果确立了SIM-fdFLIM作为保比值定量超分辨寿命成像平台的地位，将活细胞FLIM拓展至一个兼具纳米级空间分辨率、Hz级采集速率与寿命保真度的新范畴。

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